什么是光散射現象

    光線通過不均一環境時，發生的部分光線改變了傳播方向的現象被稱作光散射，這部分改變了傳播方向的光稱作散射光。宏觀上，從陽光被大氣中空氣分子和液滴散射而來的藍天和紅霞到被水分子散射的蔚藍色海洋，光散射現象本質都是光與物質的相互作用。

    顆粒與光的相互作用

    微觀上，當一束光照在顆粒上，除部分光發生了散射，還有部分發生了反射、折射和吸收，對于少數特別的物質還可能產生熒光、磷光等。

當入射光為具有相干性的單色光時，這些散射光相干后形成了特定的衍射圖樣，米氏散射理論是對此現象的科學表述。如果顆粒是球形，在入射光垂直的平面上觀察到稱為艾里斑的衍射圖樣。

▲  顆粒散射激光形成艾里斑

    激光粒度儀原理

    光散射的空間分布探測分析

▲ 艾里斑與光能分布曲線

    當我們觀察不同尺寸的顆粒形成的艾里斑時，會發現顆粒的尺寸大小與中間的明亮區域大小一般成反相關。現代的激光粒度儀設計中，通過在垂直入射光的平面距中心點不同角度處依次放置光電檢測器進行粒子在空間中的散射光能分布進行探測，將采集到的光能通過相關米氏散射理論反演計算，就可以得出待分析顆粒的尺寸了。

    這種以空間角度光能分布的測量分析樣品顆粒分散粒徑的儀器即是靜態光散射激光粒度儀，由于測試范圍寬、測試簡便、數據重現性好等優點，該方法儀器使用最廣泛，通常被簡稱為激光粒度儀。

    根據激光波長（可見光激光波長在幾百納米）和顆粒尺寸的關系有以下三種情況：

    1、當顆粒尺寸遠大于激光波長時，艾里斑中心尺寸與顆粒尺寸的關系符合米氏散射理論在此種情況下的近似解，即夫瑯和費衍射理論，老式激光粒度儀亦可以通過夫瑯和費衍射理論快速準確地計算粒徑分布。

    2、當顆粒尺寸與激光波長接近時，顆粒的折射、透射和反射光線會較明顯地與散射光線疊加，可能表現出艾里斑的反常規變化，此時的散射光能分布符合考慮到這些影響的米氏散射理論規則。通過準確的設定被檢測顆粒的折射率和吸收率參數，由米氏散射理論對空間光能分布進行反演計算即可得出準確的粒徑分布。

    3、當顆粒尺寸遠小于激光波長時，顆粒散射光在空間中的分布呈接近均勻的狀態（稱作瑞利散射），且隨粒徑變化不明顯，使得傳統的空間角度分布測量的激光粒度儀不再適用。

    總的來說，激光粒度儀一般最適于亞微米至毫米級顆粒的分析。

▲ 歐美克Topsizer Plus 激光粒度分析儀

    Topsizer Plus激光粒度儀的測試范圍達0.01-3600μm，根據所搭配附件的不同，既可測量在液體中分散的樣品，也可測量須在氣體中分散的粉體材料。

    納米粒度儀原理

    光散射的時域漲落探測(動態光散射)分析

    對于小于激光波長的懸浮體系納米顆粒的測量，一般通過對一定區域中測量納米顆粒的不定向地布朗運動速率來表征，動態光散射技術被用于此時的布朗運動速率評價，即通過散射光能漲落快慢的測量來計算。

    顆粒越小，顆粒在介質中的布朗運動速率越快，儀器監測的小區域中顆粒散射光光強的漲落變化也越快。然而，當顆粒大至微米級后，顆粒的布朗運動速率顯著降低，同時重力導致的顆粒沉降和容器中介質的紊流導致的顆粒對流運動等均變得無法忽視，限制了該粒徑測試方法的上限。基于以上原因，動態光散射的納米粒度儀適宜測試零點幾個納米至幾個微米的顆粒。

    Zeta電位儀原理

    電泳中顆粒光散射的相位探測分析

    納米顆粒大多有較活潑的電化學特性，納米顆粒在介質中滑動平面所帶的電位被稱為Zeta電位。當在樣品上加載電場后，帶電顆粒被驅動做定向地電泳運動，運動速度與其Zeta電位的高低和正負有關。與測量布朗運動類似，納米粒度儀可以測量電場中帶電顆粒的電泳運動速度表征顆粒的帶電特性。

    通常Zeta電位的絕對值越高，體系內顆粒互相排斥，更傾向與穩定的分散。由于大顆粒帶電更多，電泳光散射方法適合測量2nm-100um范圍內的顆粒Zeta電位。

    通常高品質的納米和Zeta電位分析儀還能分析顆粒的電位分布，對于顆粒的改性，修飾，活化或裝配的表面一致性進行評價，從而提高工藝水平和產品質量。

▲ 歐美克NS-90Z Plus 納米粒度電位分析儀

    NS-90Z Plus納米粒度及電位分析儀采用動態光散射技術測量粒子和顆粒的粒度，采用電泳光散射技術測定顆粒Zeta電位和電位分布，同時兼有靜態光散射技術用于測定蛋白質與聚合物等的分子量。NS-90Z Plus融合馬爾文帕納科恒流模式下的M3-PALS快慢場混合相位檢測分析技術，提升了儀器的電位分析性能，升級了兼容多種樣品池 (選配) 功能，可分析樣品濃度和粒度范圍也得到了明顯提升。

    如何根據應用需求選擇合適的儀器

    為了區分兩種光散射粒度儀，激光粒度儀有時候又被稱作靜態光散射粒度儀，而納米粒度儀有時候也被稱作動態光散射粒度儀。

    需要說明的是，由于這兩類粒度儀測量的是顆粒的散射光，而非對顆粒成像。如果多個顆粒互相沾粘在一起通過檢測區間時，會被當作一個更大的顆粒看待。因此這兩種光散射粒度儀分析結果都反映的是顆粒的分散粒徑，即當顆粒不完全分散于水、有機介質或空氣中而形成團聚、粘連、絮凝體時，它們測量的結果是不完全分散的聚集顆粒的粒徑。

    綜上所述，在選購粒度分析儀時，基于測量的原理宜根據以下要點進行取舍：

    1、樣品的整體顆粒尺寸

    根據具體質量分析需要選擇對所測量尺寸變化更靈敏的技術。通常情況下，激光粒度儀適宜亞微米到幾個毫米范圍內的粒徑分析；納米粒度儀適宜全納米亞微米尺寸的粒徑分析，這兩種技術測試能力在亞微米附近有所重疊。

▲ 顆粒的尺寸

▲動態光散射NS-90Z Plus 納米粒度儀測試膠體金顆粒直徑

Z-average 34.15nm

    2、樣品的顆粒離散程度

一般情況下兩種儀器對于單分散和窄分布的顆粒粒徑測試都是可以輕易滿足的。對于顆粒分布較寬，即離散度高/顆粒中大小尺寸粒子差異較大的樣品，可以根據質量評價的需求選擇合適的儀器。

    例如要對納米鈣的分散性能進行評價，關注其微米級團聚顆粒的含量與納米顆粒的含量比例，有些工藝不良的情況下團聚的顆粒可能達到十微米的量級，激光粒度儀對這部分尺寸和含量的評價真實性更高一些。如果需要對納米鈣的沉淀工藝進行優化，則需要關注的是未團聚前的一般為幾十納米的原生顆粒，可以通過將團聚大顆粒過濾或離心沉淀后，用納米粒度儀測試，結果可能具有更好的指導性，當然條件允許的情況下也可以選用沉淀漿料直接測量分析。

    有些時候樣品中有少量幾微米的大顆粒，如果只是定性判斷，納米粒度儀對這部分顆粒產生的光能更敏感，如果需要定量分析，則激光粒度儀的真實性更高。對于跨越納米和微米的樣品，我們經常需要合適的進行樣品前處理，根據質量目標選用最佳質控性能的儀器。

▲ 顆粒的離散程度

▲ 靜態光散射法Topsizer激光粒度儀測試兩個不同配方工藝的疫苗制劑

▲ 動態光散射NS-90Z Plus 納米粒度儀測試疫苗制劑直徑

    激光粒度儀測試結果下圖納米粒度儀的結果是來自同一個樣品，從分布圖和數據重現程度上看，1μm以下，納米粒度儀分辨能力優于激光粒度儀；1μm以上顆粒的量的測試，激光粒度儀測試重現性優于納米粒度儀；同時對于這樣的少量較大顆粒，動態光散射納米粒度儀在技術上更敏感（測試的光能數據百分比更高）。

    在此案例的測試儀器選擇時，最好根據質控目標來進行，例如需要控制制劑中大顆粒含量批次之間的一致性可以選用激光粒度儀；如果是控制制劑納米顆粒的尺寸，或要優化工藝避免微米級顆粒的存在，則選用動態光散射納米粒度儀更適合。

    3、測試樣品的狀態

    激光粒度儀適合粉末、乳液、漿料、霧滴、氣溶膠等多種顆粒的測試，納米粒度儀適宜膠體、乳液、蛋白/核酸/聚合物大分子等液相樣品的測試。

    通常激光粒度儀在樣品濃度較低的狀態下測試，對于顆粒物含量較高的樣品及粉末，需要在測試介質中稀釋并分散后測試。對于在低濃度下容易團聚或凝集的樣品，通常使用內置或外置超聲輔助將顆粒分散，分散劑和穩定劑的使用往往能幫助我們更好的分離松散團聚的顆粒并避免顆粒再次團聚。

    納米粒度儀允許的樣品濃度范圍相對比較廣，多數樣品皆可在原生狀態下測試。對于稀釋可能產生不穩定的樣品，如果測試尺寸在兩者都許可的范圍內，優先推薦使用納米粒度儀，通常他的測試許可濃度范圍更廣得多。

▲ 多種狀態的顆粒樣品

    如果顆粒測試不穩定，通常需要根據顆粒在介質體系的狀況，例如是否微溶，是否親和，靜電力相互作用等，進行測試方法的開發。

    例如，通過在介質中加入一定的助劑/分散劑/穩定劑或改變介質的類別或采用飽和溶液加樣法等，使得顆粒不易發生聚集且保持穩定，大多數情況下也是可以準確評價樣品粒徑信息的。當然，在對顆粒進行分散的同時，宜根據質量分析的目的進行恰當的分散，過度的分散有時候可能會得到更小的直徑或更好重現性的數據，但不一定能很好地指導產品質量。例如對脂質體的樣品，超聲可能破壞顆粒結構，使得粒徑測試結果失去質控意義。

    4、制劑穩定性相關的表征

    顆粒制劑的穩定性與顆粒的尺寸、表面電位、空間位阻、介質體系等有關。一般來說，顆粒分散粒徑越細越不容易沉降，因此顆粒間的相互作用和團聚特性是對制劑穩定性考察的重要一環。當顆粒體系不穩定時，則需要選用顆粒聚集/分散狀態粒徑測量相適宜的儀器。

    此外，選用帶電位測量的納米粒度儀可以分析從幾個納米到100微米的顆粒的表面Zeta電位，是評估顆粒體系的穩定性及優化制劑配方、pH值等工藝條件的有力工具。

▲ 顆粒的分散狀態

    5、顆粒的綜合表征

    顆粒的理化性質與多種因素有關，任何表征方法都是對顆粒的某一方面的特性進行的測試分析。要準確且更系統地把控顆粒產品的應用質量，可以將多種分析方法的結果進行綜合分析，也可以輔助解答某一方法在測試中出現的一些不確定疑問。例如結合圖像儀了解激光粒度儀測試時樣品分散是否充分，結合粒徑、電位、第二維利系數等的分析綜合判斷蛋白制劑不穩定的可能原因等。